Takdim

Siyah çay üretimi süresince çay yapraklarının polifenol oksidaz aktivitelerinde ki değişmeler incelendi. Yapraklarda ki polifenol oksidaz aktivitesi yaz aylarında ilk bahardan daha yüksekti ve siyah çay için ayrılan çay klonları ile yeşil çay için ayrılan klonlar karşılaştırıldığında siyah çay için ayrılanlarda daha yüksek polifenol oksidaz aktivitesinin var olduğu görüldü.

Yapraklarda ki enzim aktivitesi soldurma periyodu süresince kademeli olarak yükselirken, soldurma sıcaklığı en yüksekte iken enzim aktivitesi de daha da hızlı yükseldi. Enzim aktivitesi yüksek ve düşük ısı derecelerinde soldurulmuş yaprakların her ikisinde de  kıvırma ile hızlı şekilde yükselirken, taze yapraklardakinden  2–3  kat daha fazla arttı.Kıvırmadan sonra fermantasyon işlemi boyunca enzim aktivitesi kademeli olarak düşerken yüksek fermantasyon sıcaklığında enzim aktivitesinde de büyük düşüşler gözlendi.

Polifenol oksidaz enzim proteinleri ile kateşinler arasında çözünmeyen bileşiklerin oluşumu, fermantasyon süresince enzim aktivitesinde azalmaya neden olduğu bilinmektedir. Üç yaprak ve bir tomurcuktan oluşan siyah ve yeşil çayın üretiminde kullanılan çay sürgününün körpe kısımları çay ürünü olarak tanımlanır. Siyah çay üretiminde ilk adım solma işlemidir. Taze yapraklarda ki %75-80 rutubet miktarının  %60 dolaylarına indirilmesi de bu işlemle yapılmaktadır. İkinci aşama kıvırma işlemidir. Burada solmuş yapraklar 60 dakikalık bir süreyle kıvrılır ve parçalanır. Sonra bu kıvrılmış yapraklar 25^oC de muhafaza edilirler ki bu 25^oC de takriben 2 saatlik bir fermantasyondan aşamasıdır, sonra yapraklar fırınlanır ve kurutulur.

Siyah çay üretim işlemi boyunca yapraklarda oluşan önemli kimyasal değişikliklerden biri polifenollerin oksidasyonudur. Bu reaksiyon son ürün olan siyah çayın kalitesini etkiler. Yapraklarda ki polifenol oksidaz suda çözünen ve çözünmeyen unsurlarında her ikisinin de oluşumunda etkindir, ikincisinin oluşumundaki (suda çözünmeyen bileşikler)  aktivitesi daha güçlüdür.

Son zamanlarda araştırmacılar suda çözünmeyen bileşikleri aseton muamelesiyle çözmüş ve suda eriyebilen enzimler üzerine çalışabilmişlerdi. Siyah çay fermantasyonunda polifenollerin oksidasyon oranı bu enzim (PPO) aktivitesinin yoğunluğuna bağlıdır. Siyah çay üretim işlemleri boyunca enzim aktivitelerinin düzeyinde ki değişiklikler bu çalışma ile incelenmiştir.

Bu deneme, üretim işlemi boyunca yaprakların polifenol oksidaz aktivitesindeki değişimler üzerine daha ayrıntılı çalışmayı hedeflemiştir.. Özelliklede soldurma, kıvırma ve fermantasyon boyunca yaprakların sıcaklığının enzim aktivitesi üzerine etkileri ve solma periyodunun uzunluğu incelenmiştir.

Materyal  ve  Metot

Aseton Tozunun Hazırlanması : Bu araştırmada kullanılmış yapraklar çay araştırma istasyonunun bahçesinden toplanmıştır. Siyah çay üretiminde ki her aşamada yaprak örnekleri aseton tozu preparatı içine alınarak hazırlandı ve bir Waring Blender da soğuk aseton ile homojenize hale getirildi. Kıyılmış küçük parçalar (dhool) renksizleşinceye kadar soğuk asetonla birkaç kez yıkanıp elde edilen toz ( pudra) 5 ^oC nin altında bir vakumda kurutuldu.

Polifenol Oksidaz Aktivitesi :  Polifenol oksidaz aktivitesi, önceki sayfalarda tanımlanmış olan manometrik metot ile ölçüldü ve  25 ^oC ‘de 10 veya 15 dakika süreyle absorbe  etmiş oldukları O₂ ‘nin  µl olarak ifade edildi. Polifenol oksidaz aktivitesi aşağıda ki karışımın reaksiyonu ile belirlendi. 6x10^–2 M nın 1.0 ml Sodyum fosfat, 3x10^–2 M Sitrik asit tamponu  (pH = 5.75) 10^–2 M nin 2.0 ml (+) kateşin eriyiği ve sıvı içinde erimeden kalan (süspansiyon  aseton tozunun 1.0 ml (yaklaşık nitrojenin (azotun) 1.0 mg).

İlk denemeler fermantasyonda değişime uğrayan madde konsantrasyonunun yukarda ki deneme koşulları altında gözlenen reaksiyon karışımının pH’sı, maksimal aktiviteyi sürdürmek için yeterliydi ve karışım reaksiyonunun oranı 2 mg üzerinde ki nitrojen (N) enzim konsantrasyonuna orantılıydı ve reaksiyon eğrisi 25^oC de takriben 20 dakika için doğru ( lineer) bir çizgi göstermişti.

Reaksiyon Karışımının Renk Yoğunluğunun Ölçülmesi :  Bu enzim (PPO) ile (+) kateşinin oksidasyonundan sonra , reaksiyon karışımı (polifenol oksidaz deneyi için kullanılmış olanın aynısı) buzlu suda soğutuldu. Sonra bu reaksiyon karışımına n – botanol ilave edilir ve (+) kateşinin portakal renkli okside edilmiş ürünleri n – butanol tabakasına taşınır. Bu n – botanol’dan 25 ml doldurulur ve 430 mµ sıfırlama absorbansı ile bir spektrofotometre kullanılarak belirlenir. Reaksiyon karışımının n – butanol solventi ile background ( zemin - geri plan ) düzeltmesi yapılır.

(+) Kateşin İçin Ölçümleme : Reaksiyon karışımında ki (+) kateşin konsantrasyonu reaksiyon öncesi ve sonrası her iki durumda Nakagawa ve Torii tarafından rapor edilmiş kağıt kromotografik metot ile belirlenmiştir.

Aseton Tozunun (Pudrasının) Nitrojen Miktarının Tahlili : Aseton pudrasında ki nitrojen ( N ) miktarları Kjeldahl metodu ile tespit edilmiştir.

Sonuçlar ve Tartışma

Dört çay klonunun toplama mevsimlerinde çay yapraklarında ki enzim aktivitesinin değişimi ile siyah çay üretim işlemi boyunca yapraklarda ki polifenol oksidaz değişimleri ve dört çay klonunun farklı toplama mevsiminde ki PPO değişimleri araştırıldı. Tablo1 de gösterildiği gibi solmuş yapraklarda enzim aktivitesi taze yapraktakinden takriben  1,5 – 3  kat daha fazla artmıştır. Dört çay klonunun yaprak larında ki enzim aktivitesi ile yukarıda sözü edilen solmuş çay yapraklar karşılaştırıldığında, solmuş yapraklarda ki enzim aktivitesi taze yapraklardakinden daha yüksek olduğu sonucu çıkmıştır ve böylece enzim aktivitesinin düzeyinin karşılaştırması da kolaylaşmıştır.

Tablo 2 de görüldüğü gibi yaz yapraklarında ki (Temmuz) enzim aktivitesi, bahar (Mayıs) yapraklarından daha yüksektir. Bu klonlar arasında siyah çay için üretilen Benihomare ve Indo klolarının enzim aktiviteleri, yeşil çay için üretilen Yabukita klonundan daha yüksektir. Siyah çay klonu olan Hatsumomijinin enzim aktivitesi takriben Yabukita’nın ki ile aynıydı. Hatsumomijinin çay yapraklarından yapılmış siyah çayın kalite düzeyi Benihomare ve Indo’nun den daha düşüktü. Özellikle Hatsumomijinin çay deminin renginin yoğunluğu Benihomare ve Indo’nun kinden daha zayıftı. Hatsumomijinin yapraklarında ki polifenollerin oksidasyonunun derecesinin diğer ikisinden daha düşük olduğu görüldü.

Çay Yapraklarının Enzim Aktivitesi Üzerine, Soldurma ve Kıvırmanın Etkileri

Grafik 1 ve Tablo 3‘de gösterildiği gibi 15–18 saat süre içerisinde, 5–6 saatlik aralarla solmuş yaprakta rutubet miktarı ve polifenol oksidaz aktivitesi ölçülmüştür. Solmuş yapraktan fermente edilmiş yaprağın ve kıvrılmış yaprağın enzim aktiviteleri sırası ile ölçüldü. Polifenol oksidaz aktivitesi yapraklarda soldurma periyoduna geçişleri ile tedrici olarak yükselirken, normal soldurma periyoduna tekabül eden 15–18 saatlik soldurmadan sonra, taze yapraktakinden 2 – 4 kat daha yüksek bir değere ulaştı.
Yaprağı kıvırdıktan hemen sonra, her kıvrılmış yaprağın enzim aktivitesi hızlı bir şekilde taze yapraktakinden 2 – 5 kat daha fazla yükselirken, kıvrılmış yapraktaki  maksimum enzim aktivitesi , yaprağın solma derecesine bakmaksızın takriben aynı düzeyde kalmıştı. Bu sonuçlardan görüldüğü üzere, enzimin aktivasyonu yapraklarda soldurma ve kıvırma boyunca biyokimyasal değişikliklerin oluşmasına neden olmuştur. Enzim aktivasyonu üzerine kıvırmanın etkisi soldurmadan daha büyüktür.

Soldurma  Sıcaklığının  Enzim  Aktivitesi  Üzerine  Etkileri

Yapraklar üç eşit parçaya bölündü ve her parça  25oC–35oC veya 45oC de %80–60  veya 30 nisbi rutubetteki soldurma koşulları altında, her bir parçadaki yapraklarının rutubet miktarı %75’den  %60‘a düşünceye kadar solduruldu ve sonra solmuş ve kıvrılmış yaprağın polifenol oksidaz aktivitesi belirlendi. Solma periyodunun uzunluğu, yapraklarda ki rutubet miktarında ki değişmeler ve soldurma işlemi boyunca yaprağın sıcaklığı  Tablo 4 ‘de özetlenmiştir.               % 80  Nispi rutubet altında ki ısı derecelerinde soldurma periyodunun uzunluğu,   %30 nispi rutubet altındakinden 2  kat daha uzundur. 25 ve 35oC de soldurma ısısında , çay yapraklarının ısı derecesi sırasıyla üç misli rutubet altında ki soldurma ısı derecesi ile takriben yakın değerlerde olduğunu gösterdi. Ama daha yüksek nispi rutubet,  45oC  gibi daha yüksek yaprak ısı derecesinin oluşmasına neden oldu.

Grafik 2‘ de soldurma boyunca yapraklarda ki enzim aktivitesinde ki değişmeler gösterilmiştir. Daha uzun soldurma periyodu aynı ısı derecesinde soldurulmuş yaprakta enzim aktivitesinin daha yüksek olduğunu gösterdi ve aynı zamanda da bu daha yüksek solma derecesi ile solmuş yapraklarda enzim aktivitesinin daha hızlı yükselmesi demektir. Bu sonuçlardan soldurma işlemi boyunca enzim aktivasyonunun oranının soldurma ısı derecesi tarafından etkilendiğini ve yüksek ısı derecesinde  (45oC)  enzim aktivitesindeki yükselmenin de hızlandığını gösterirken , çay yapraklarını düşük ısı derecesinde tutmak (5oC depolanmış çayda rutubet oranının kaybolmasına neden olmasına rağmen, uzun periyotlar da  dört günden fazl) polifenol oksidazın aktivasyonunu baskı altında aldığı görülmüştür. 25oC ‘den 45C ’ ye kadarki soldurma derecelerinde , soldurulmuş yaprakların her parçası aynı kıvırma işlemine tabi tutulduğu zaman , kıvrılmış yapraklarda ki enzim aktivitesi takriben aynı değerleri gösterir   130 – 150 O 2 µl / 15 dakika / N mg) . Bu demektir ki  solmuş yaprakta ki enzim aktivitesi, farklı soldurma şartlarına bağlılığı düzensiz bir şekilde değişse bile, bunlar kıvrılmış yapraklarda takriben aynı düzeye yükselirler. Kıvırma ve Fermantasyon İşlemlerinde Çay Yapraklarındaki Enzim Aktivitesinin Değişimi : Grafik 3‘de kıvırma ve fermantasyon işlemlerinde çay yapraklarının enzim aktivitesinde ki değişiklikler gösterilmiştir. Yapraklarda ki enzim aktivitesi fermantasyon periyodu geçişlerinde tedricen azalmıştır. Grafik 4‘de gösterildiği gibi daha yüksek fermantasyon ısı derecesinde, enzim aktivitesinin azalma oranının daha büyük olduğu görülmüştür ve 45oC‘ de kıvrılmış yapraklarda enzim aktivitesi, kıvırmadan hemen sonra azalmıştır. Kıvırma ve fermantasyon boyunca enzim aktivitesinde ki azalmanın, fermantasyon ve kıvırma ısı derecesi tarafından teşvik edildiği kabul edilmektedir. Ama Grafik 5 de görüldüğü gibi enzim aktivitesinin maksimum oranını 35 ve 40oC arasında sergilendiği ve enzim aktivitesinde ki azalmanınsa  45oC ‘ de olduğudur. Bu yüzden kıvırma ve fermantasyon işlemleri boyunca enzim aktivitesinde ki azalmaya, kıvırma ve fermantasyon ısı dereceleri tarafından etkilenen enzim proteini ve polifenol oksidaz’ın oluşturduğu bileşiklerin sebep olunduğu düşünülmektedir. Polifenollerin oksidasyonunda çözünmeyen bileşiklerde ki artış ile PPO aktivitesi azalmış ve enzim reaksiyonunun oranı, maksimum reaksiyon hızında bile polifenolün yoğunluğundaki yükseliş ile azalmıştır.

Bu sonuçlardan görüldüğü üzere, oksidasyon ürünlerinin oluşum oranlarının hızı, reaksiyon ısı derecesinde ki yükselme ve enzim aktivitesindeki azalmayla sonuçlandı. Renkli oksidasyon  bileşiklerinin oluşumu reaksiyon karışımının n – butanol tabakasının absorbans değerinde meydana gelen yükselme tarafından belirlendi. (+)– Kateşinlerin oksidasyonunda tüketilen toplam oksijen miktarı, takriben reaksiyonun ısı derecesiyle doğru orantılıydı. Gerçekte okside olmuş ürünlerin polimerizas yonunun oranı  o – quinon için yüksek ısı derecelerinde daha büyüktü. Renkli oksidasyon ürünlerindeki ( TF ve TR ) birikmenin enzim aktivitesi üzerine azaltıcı etkisi vardı.

---

Tercüme: Kamil Engin İSLAMOĞLU, Ziraat Mühendisi, E-Mail 

---

Kaynak: T. TAKEO. 1986. Tea Leaf Polyphenol Oxidase. Part III. Studies on the Changes of Polyphenol Oxidase Activity During Black Tea Manufacture. Agr. Biol. Chem. Vol. 30 , No. 6 , p. 529 ~ 535. (1986) Tea  Research Station, Ministry of Agriculture and Forestry, Kanaya,   Shizuoka,  JAPAN. Recived November 11, 1986